將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

　　原代細(xì)胞培養(yǎng)的步驟一般是：取材→分離→培養(yǎng)和維持，今天我們重點(diǎn)介紹原代細(xì)胞的取材和分離方法。

　　一、取材

　　人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

　　取材的基本要求：

　　① 取材要注意新鮮和保鮮

　?、?應(yīng)嚴(yán)格無菌

　?、?防止機(jī)械損傷

　　④ 去除無用組織和避免干燥

　?、?應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等

　?、?作好記錄

　　各類組織的取材技術(shù)：

　　① 皮膚和粘膜的取材

　　主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4平方厘米。

　?、?內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

　　內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。

　?、?血液細(xì)胞的取材

　　血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝。

　?、?骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

　　嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。

　　⑤ 動物組織取材

　　I 鼠胚組織取材

　　首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。

　　II 幼鼠胚腎(或肺)取材

　　幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。

　?、?雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟

　　1、取孵化至適當(dāng)胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。

　　2、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;

　　經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;

　　3、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;

　　4、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

　　二、原代細(xì)胞的分離

　　人或動物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。

　　1、懸浮細(xì)胞的分離方法

　　組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最-簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

　　2、實(shí)體組織材料的分離方法

　　對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。

　?、?機(jī)械分散法

　　特點(diǎn):簡便、快速,但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。

　　② 消化分離法

　　組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

　?、?酶消化分離法

　　酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

　　胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。

　　膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。

　　除上述兩種最-常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶

　　Ⅱ 非酶消化法(EDTA消化法)

　　EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。

　　Ⅲ 消化分離法的操作步驟

　　剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散

　?、?消化分離法的注意事項(xiàng)

　　組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

　　胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

　　消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。